原代細胞的取材和分離方法

　　將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

　　原代細胞培養的步驟一般是：取材→分離→培養和維持，今天我們重點介紹原代細胞的取材和分離方法。

　　一、取材

　　人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。

　　取材的基本要求：

　　① 取材要注意新鮮和保鮮

　　② 應嚴格無菌

　　③ 防止機械損傷

　　④ 去除無用組織和避免干燥

　　⑤ 應注意組織類型、分化程度、年齡等

　　⑥ 作好記錄

　　各類組織的取材技術：

　　① 皮膚和粘膜的取材

　　主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。

　　② 內臟和實體瘤的取材

　　內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。

　　③ 血液細胞的取材

　　血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。

　　④ 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材

　　嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。

　　⑤ 動物組織取材

　　I 鼠胚組織取材

　　首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。

　　II 幼鼠胚腎(或肺)取材

　　幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。

　　⑥ 雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟

　　1、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。

　　2、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;

　　經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;

　　3、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;

　　4、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

　　二、原代細胞的分離

　　人或動物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來。

　　1、懸浮細胞的分離方法

　　組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最-簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。

　　2、實體組織材料的分離方法

　　對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。

　　① 機械分散法

　　特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。

　　② 消化分離法

　　組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。

　　Ⅰ 酶消化分離法

　　酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

　　胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開。

　　膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用。

　　除上述兩種最-常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶

　　Ⅱ 非酶消化法(EDTA消化法)

　　EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。

　　Ⅲ 消化分離法的操作步驟

　　剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散

　　Ⅳ 消化分離法的注意事項

　　組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

　　胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

　　消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。