細胞傳代時間經驗技巧

　　養細胞的小伙伴們都知道，細胞一定要傳代，因為細胞在培養過程中不斷的繁殖，數量也隨之增加，然而培養皿/培養瓶的空間有限，增殖受到抑制，所以必須將一部分細胞移至別的培養皿/培養瓶，讓細胞有足夠生長空間。

　　細胞傳代也不僅僅是為細胞安一個更大的“家"，更重要的，是使細胞系或細胞株進一步增殖，這樣，我們才能有足夠的細胞做各種各樣的實驗。

　　但是，對于傳代的時間，很多小伙伴都掌握不好，因為對于不同的細胞來說，判斷能否開始傳代的標準略有不同，今天，我們就主要來聊一下，細胞傳代的時間問題。

　　什么時候進行細胞傳代?

　　對于貼壁培養和懸浮培養而言，判斷是否需要傳代主要看以下2個方面：

　　• 細胞密度：

　　貼壁培養細胞進入對數生長期、未達到匯合狀態時即應進行傳代，正常細胞達到匯合狀態時會停止生長 (接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復，轉化細胞即使達到匯合狀態也能繼續增殖，但是在經過大約兩個倍增時間后通常會變質。類似地，

　　懸浮培養的細胞進入對數生長期、未達到匯合狀態時也應進行傳代。達到匯合狀態時，懸浮培養的細胞會聚集成團塊，轉動培養瓶時培養基會變得渾濁。

　　• 培養基耗竭：

　　生長培養基 pH 值降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細胞代謝的副產物。乳酸有細胞毒性，而且 pH 值降低也是細胞生長的不利因素。pH 值改變的速度通常取決于培養體系中的細胞濃度，細胞濃度越高，培養基耗竭的速度越快。

　　如果發現 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 單位)，同時細胞濃度增大，則應對細胞進行傳代。

　　細胞傳代時間安排

　　注意，一定要嚴格按照預定時間進行細胞傳代，這樣才能確保細胞的生物學行為穩定，便于監測其健康狀態。

　　要從某一接種密度開始逐漸調整細胞接種密度，直到達到適合該細胞的穩定生長速度和產量，細胞偏離如此確定的生長模式通常表示細胞健康狀況不佳 (例如：變質、污染) 或者培養體系的某一組分功能異常 (例如：未達到最佳溫度，培養基過于陳舊)。

　　強烈建議大家保留詳細的細胞培養記錄，記錄加料和傳代時間、所用培養基種類、解離方法、分種率、形態學觀察結果、接種濃度、產量和抗生素用法。

　　最好按照傳代時間安排開展實驗和其他非常規操作 (如更換培養基種類)，如果您的實驗安排與常規傳代時間安排不吻合，則應確保當細胞仍處于延滯期或者已經達到匯合狀態、停止生長時，不進行傳代。

　　貼壁細胞傳代流程:

　　以下實驗方案介紹了貼壁細胞和懸浮細胞傳代的一般流程,為自己所用的細胞系傳代時，建議您嚴格遵守實驗中所有產品附帶的操作說明,偏離某種細胞所需的培養條件會導致細胞表型異常，甚至培養*失敗。

　　(1)傳代前準備

　　用具紫外照射消毒(30min)：無菌培養瓶，15ml離心管，移液管，移液槍，槍頭。

　　倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。

　　(2)胰蛋-白酶/EDTA消化

　　從培養箱中取出待傳代的細胞(將蓋子擰緊)，75%酒精進行瓶口消毒，吸掉培養細胞的舊培養基，PBS緩沖液洗去殘留的舊培養基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA濃度視不同細胞而定。放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內，加入6ml細胞*培養基中止消化，消化時間為1-5min，具體以細胞而議，采用無菌吸管輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的細胞懸液放入干凈的15ml離心管內，每分鐘1000rpm，RT5min。

　　(3)制備細胞懸液及培養

　　吸取上清液丟棄，不要吸到底部的細胞沉淀，向離心管內的細胞沉淀加入適量*培養基，吹打混勻，吹打過程中盡量不要產生氣泡，以1:2的比例進行分瓶。

　　(4)結果觀察

　　第二天觀察細胞情況，細胞培養換液時間一般2-3天。

　　(5)注意事項

　　1 嚴格無菌

　　2 適度消化：把握好消化液的最佳濃度

　　3 吹打細胞動作要輕柔

　　懸浮細胞傳代流程

　　懸浮細胞傳代就比較容易了，可以直接將培養瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養液即可。當細胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離心管內，1000-1500rpm離心3min，棄上清，加入約2ml培養液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養液的培養瓶中，然后置于二氧化碳培養箱中培養。