細胞培養中常見細胞污染類型及預防辦法

凡混入細胞培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染，細胞污染不能*被消除，但能減少其發生的頻率和后果的嚴重性。

本文將簡要介紹幾種常見的細胞污染類型及處理方法。

常見污染類型

細菌污染

特征：大小在0.5~5 μm，比動物細胞小很多。多呈球狀或桿狀，形態規則，分布均勻；增殖速度快，一般污染后48~72小時爆發式增殖；營養消耗快，培養基很快變黃，變渾濁；鏡下觀察有明顯的定向運動。

處理方法：輕度污染可用10X雙抗清洗處理，重度污染建議消殺后丟棄。

真菌污染

特征：呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見的菌落，培養基顏色無變化或變紫，僅對局部細胞影響較大，其他地方生長正常。會形成孢子，容易污染其他細胞。

處理方法：真菌污染較難根-除，不建議保留，建議消殺后丟棄。

支原體污染

特征：最小的微生物，無法通過光學顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。感染支原體的細胞，在某一時間點碎片突然增多，隨著傳代，細胞狀態顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細胞房其他細胞。

鑒定方法：PCR法、顯色法、熒光染色法等。

處理方法：若細胞狀態尚可，添加支原體抑制劑培養2-3代可轉陰；若細胞狀態很差，建議消殺后丟棄。

黑膠蟲污染

特征：無明確定義，鏡下無法直接觀察到。主要表現為細胞狀態差，黑點和碎片多，布朗運動。通過檢測發現主要為支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。

處理方式：若細胞狀態尚可，添加黑膠蟲/支原體抑制劑培養2-3代可轉陰；若細胞狀態很差，建議消殺后丟棄。

細胞交叉污染

特征：即不同的細胞混雜在一起

鑒定方法：

同種屬：STR鑒定，多等位基因數大于3個。
（需考慮本身的遺傳背景，如EA.hy 926為融合細胞，本身就包含兩套遺傳信息）

不同種屬：PCR法，對種屬特異性基因進行擴增，不同種屬產物大小不同。

處理方法：建議重新引種。

細胞污染后的處置

細胞一旦發現有污染出現，應及時對所用試劑和耗材進行清理。耗材可更換新的或者重新高壓滅菌，試劑可重新過濾除菌或者更換新批次，操作臺和細胞房需用消毒液進行全面清潔消殺后方可復蘇新的細胞，以免反復出現污染。

污染防治策略

1 細胞房環境控制

環境要求：

潔凈區10000級，局部100級，定期進行沉降菌檢測

環境消毒：每周一次定期消毒滅菌

1） 地面/墻面：84消毒液、新潔爾滅交叉使用

2） 環境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸

3） 儀器設備表面：75%酒精擦拭

2 實驗人員管理

著裝：著連體衣，戴口罩、手套，頭發、手腕等要包好，減少皮膚外露。

行為：減少走動，出入關門，操作時不要講話。

技能：養成良好的無菌操作習慣。

其他：減少共用物品，公共使用區域統一使用習慣，區分潔凈區域和有風險的區域。

3 實驗用品管理

試劑：使用前確保無菌，自己配制的試劑需過濾除菌后再使用。

耗材：需要重復使用的耗材確保按照規定清洗、高溫高壓滅菌，使用滅菌指示帶。滅菌后烘干的耗材立刻放進超凈臺，一周內使用完畢，未使用完的，需重新滅菌再使用。

儀器設備：定期擦拭消毒，培養箱、顯微鏡托盤等高風險區域需經常清潔，培養箱水盤和復蘇用的水浴鍋需添加抑菌劑。

其他：當出現培養物泄漏時，應及時清理干凈；出現局部污染時，應找出污染源并對環境整體消毒。