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核酸適體是一段能特異性識別靶標分子的單鏈DNA或RNA，已被廣泛用于各種生物醫學應用。然而，由于適體的構象動態易變，抗環境干擾能力弱，從而影響與靶標的結合親和力以及核酸適體-靶標復合物的穩定性，因此與商業抗體相比，核酸適體在檢測和治療方面的性能通常一般。
湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室的王丹博士為我們闡述了如何合理地設計親電標簽功能化的核酸適體通過點擊化學的共價偶聯技術實現新-冠病毒的靈敏檢測和侵染阻斷，進一步推動了適體在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫學領域的應用。該研究于2023年1月2日發表于國際知-名雜志ACS Central Science (IF=18.2)，題為Robust Covalent Aptamer Strategy Enables Sensitive Detection and Enhanced Inhibition of SARS-CoV-2 Proteins。
圖1 該研究發表于國際期刊ACS Central Science
01
研究背景
為了提高結合適體親和力并減少其與靶標復合物的解離，人們開發了二價或多價適體的分子組裝策略，以及將疏水基團整合到適體中以增加結合能力的分子工程策略。然而，這些策略沒有改變適體和靶標之間的非共價結合模式，對核酸適體的結合親和力以及核酸適體-靶標復合物穩定性的提升有限。目前共價核酸適體的概念和應用還處于起步階段，并沒有被廣泛開發和認識。因此，促進共價核酸適體概念的開發和擴大共價核酸適體的應用領域將是非常重要的。
02
工作設計
為解決上述問題，作者將三種親電性官能團與核酸適體偶聯以開發共價核酸適體，作為SARS-CoV-2 蛋白的檢測探針和功能性阻斷中和劑(圖2)。三種共價核酸適體分別為硫酰氟修飾的適體(SF-Apt)，N-羥基琥珀酰亞胺修飾的適體(NHS-Apt)以及丙烯酰胺修飾的適體(Acr-Apt)。作為概念驗證，作者選擇SARS-CoV-2的核衣殼蛋白 (NP) 和刺突蛋白受體結合域 (RBD)作為研究對象探究共價核酸適體性能。NP 是 SARS-CoV-2 最保守和最-豐富的結構蛋白，是早期檢測和可靠診斷的最-佳選擇。RBD是SARS-CoV-2識別和感染宿主ACE2蛋白的關鍵蛋白。
圖2 基于共價適配體的策略，通過特異性
近距離交聯來檢測和阻斷靶蛋白
03
研究結果
NO-1
候選共價適體的合成和表征
首先，作者選擇了3種親電能力各異的共價標簽，合成了三種備選的共價核酸適體。然后通過凝膠電泳實驗綜合分析了交聯反應效率、特異性和速率，發現中等親電能力的NHS標記的共價核酸適體表現最佳，將其選為后續應用的探針。(圖3)
圖3 三種候選共價適配體的合成和表征
NO.2
N蛋白共價適體的性能表征
然后作者測試了共價核酸適體、傳統核酸適體以及抗體與NP的親和力。結果表明：與傳統核酸適體相比，共價核酸適體的解離速率常數Koff降低了2個數量級左右，親和力(Kd)提高了30-60倍左右，與抗體相當甚至優于抗體。共價適體-NP復合能耐受多次洗滌、EDTA和尿素等環境因素的干擾，且對靶蛋白的結合具有優異的選擇性。(圖4)
圖4 共價適配體策略具有更強的抗環境
干擾能力和更高的特異性結合能力
NO.3
基于共價適體的N蛋白ELISA檢測
接下來，作者比較了共價核酸適體ELISA、核酸適體ELISA和抗體ELISA檢測NP的性能。在嚴格洗滌條件下，共價核酸適體ELISA的檢測限(8.70pg/mL)和線性范圍(81–2187pg/mL)均優于抗體ELISA的檢測限(70.0pg/mL)和線性范圍(81–19683pg/mL)。另外，在嚴格的洗滌條件下，共價核酸適體ELISA具有更好的檢測特異性。(圖5)
圖5 在不同的洗滌緩沖液下使用各種探針檢測NP
NO.4
RBD蛋白共價適體的性能表征
接著，作者研究了RBD共價適體的結合和交聯性能。研究發現RBD適體偶聯上NHS標簽后，親和力提高了25倍，結合速率顯著提升且從靶標處的脫落速率顯著下降，此外共價核酸適體在生理Mg2+濃度下也能高效結合RBD蛋白。這十分有利于共價適體對新-冠病毒蛋白的中和和新-冠病毒的侵染阻斷。(圖6)
圖6 共價交聯提高適配體的結合性能并減少靶標結合處的脫落
NO.5
共價RBD核酸適配體的結合能力
最后，作者研究了共價核酸適體、抗體和核酸適體阻斷RBD與ACE2結合的能力。結果表明共價核酸適體阻斷RBD-ACE2結合的能力(IC50=0.42nM)顯著優于與抗體(IC50=1.19nM)和核酸適體(IC50=21.5nM)，結合速率更快且脫落速率更慢。因此，在模擬血管和剪切應力的循環流動裝置中，共價核酸適體比抗體和核酸適體具有更強的能力阻斷RBD和ACE2的結合。在新冠假病毒中和實驗中，共價核酸適體的半數中和濃度僅需約2nM, 最高中和效率達到95%，對比之下，抗體的半數中和濃度約6nM, 最高中和效率83%。(圖7)
圖7 共價交聯策略提高了RApt惡劣環境下介導的阻斷能力
04
結論和展望
2022年的Nobel化學獎頒給了點擊化學和生物正交化學，本研究正是利用活性很高的“Click"基團，并基于鄰近驅動的共價偶聯策略實現了對新-冠病毒的靈敏檢測和高效中和。共價策略通過將適體與靶蛋白之間的非共價結合模式轉化為共價結合模式，增強了識別能力并降低了解離速率，能進一步推動適體在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫學領域的應用。這項研究得到了國家自然科學基金、 國家重點研發計劃、浙江省自然科學基金、中國博士后科學基金和德國亞歷山大·洪堡研究基金的資助和支持。
本研究所用普諾賽產品
產品名稱 | 產品貨號 |
L-谷氨酰胺溶液(200mM)，100× | PB180420 |
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